色譜分析技術(shù):高壓液相色譜

        一、分類
??高效液相色譜可分為四種基本類型：液固色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜和尺寸排阻色譜。
?? (1) 液固色譜
??液固色譜法通常稱為吸附色譜法。吸附劑包括活性炭、氧化鋁和硅膠。液固色譜中使用的載體是硅膠。硅膠對溶質(zhì)和分子的吸附能力不是均勻分布在整個硅表面。硅膠表面有一些區(qū)域會與溶質(zhì)分子發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。這些區(qū)域是活動場所。硅膠與溶質(zhì)分子之間的主要相互作用是偶極力氫。鍵和靜電相互作用。極性越強(qiáng)，化合物在硅膠柱上的停留時間越長。在液固色譜中，流動相溶劑分子和溶質(zhì)分子競爭固定彼此的活性位置，從而使溶質(zhì)從色譜柱中洗脫下來。與硅膠表面活性位點(diǎn)結(jié)合力強(qiáng)的溶劑，對溶質(zhì)分子的洗脫能力很強(qiáng)，故稱為強(qiáng)溶劑，反之亦然。液固色譜的特點(diǎn)是適用于色譜幾何異構(gòu)體的分離，可用于脂溶性化合物，如磷脂、類固醇、脂溶性維生素、前列腺素等。
?? (2) 鍵合相色譜
??鍵合相色譜是從液-液相色譜發(fā)展而來的，即分配色譜。鍵合相色譜法將固定相與載體顆粒共價結(jié)合，克服了流動相在流動相通過色譜柱時流動中的溶解和機(jī)械沖擊的問題。性質(zhì)逐漸變化等缺點(diǎn)。鍵合相色譜可分為正相色譜和反相色譜。
??正相色譜
??在正相色譜中，與載體共價結(jié)合的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如伯氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相非常相似的非極性溶劑，如庚烷、己烷、異辛烷等。由于固定相是極性的，流動溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)，即極性越大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動相的關(guān)系與液固色譜法*相同，稱為正相色譜法。然而，正相色譜的分離原理主要是基于化合物在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，不適用于幾何異構(gòu)體的分離。
?? 2. 反相色譜
??在反相色譜中，與載體共價結(jié)合的固定相是一些直鏈烴，例如正辛基。流動相的極性強(qiáng)于固定相的極性。反相色譜在高效液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。在反相色譜中，溶質(zhì)保留的主要功能是疏水性，在高效液相色譜中也稱為疏溶劑性。所謂疏水相互作用是指當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時，溶質(zhì)分子之間的相互作用，溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子被“擠壓"從水中。出來了可見，反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動相中擠出，而且在色譜柱中的保留時間也長，因此反相色譜中不同的化合物根據(jù)其疏水性進(jìn)行分離特性。反相色譜適用于分離具有不同疏水基團(tuán)的化合物，即具有非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜可用于分離具有不同極性基團(tuán)的化合物?？梢愿淖?nèi)軇┘捌浣M成和流動相的 pH 值來影響溶質(zhì)分子與流動相的相互作用并改變它們的保留行為。此外，反相色譜流動相中水的比例非常靈活，可以/從0-100%，因此反相色譜可用于水溶性和脂溶性化合物的分離.反相色譜中的固定相是線性飽和的烷烴，它們與硅膠載體共價結(jié)合。它們的鏈長不同。最長的是十八烷基，它也是zui常用的固定相。線性飽和烷烴的疏水性隨著烴鏈的長度增加而增加，由于疏水作用，溶質(zhì)在反相色譜柱中的保留時間也會隨著烴鏈的長度增加而增加。一般來說，這意味著具有烴鏈長度的反相色譜柱可以獲得更好的分辨率。在大多數(shù)情況下，它是依靠重復(fù)選擇列。由于反相色譜的固定相是疏水性烴，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性的降低而增加。水是反相色譜中極性*的溶劑，也是最弱的溶劑。在反相色譜中，常使用堿性溶劑，并在其中加入不同濃度的可與水混溶的有機(jī)溶劑，以獲得不同強(qiáng)度的流動相。這些有機(jī)溶劑稱為改性劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑是甲醇和乙腈。此外，乙醇、四氫呋喃、異丙醇和二惡烷也常用作改性劑。
??在生化分析中，反相色譜應(yīng)用極為廣泛?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治?； ②蛋白質(zhì)的分離； ③堿基、核酸和核酸酶的分析； ④甾體化合物物質(zhì)分析； ⑤與其他酚胺、組胺、糖類和維生素的分離。
?? (3)離子交換層析
??離子交換色譜中的固定相是一些帶電基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動相中還有其他帶相反電荷的離子，根據(jù)質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。當(dāng)固定相基團(tuán)帶正電時，可交換離子為陰離子，該離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電，能與流動相交換的離子是陽離子。離子交換劑稱為陽離子交換劑。陰離子交換柱的官能團(tuán)主要是-NH2和-MH3+：陽離子交換柱的官能團(tuán)主要是-SO3H和-COOH。其中-NH3+離子交換柱和-SO3H離子交換劑是強(qiáng)離子交換劑，在較寬的pH范圍內(nèi)具有離子交換能力； -NH2和-COOH離子交換柱是弱離子交換劑，只有在一定范圍內(nèi)才有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，如氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離，蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
??二、容易出問題
??(1)渦流擴(kuò)散
??當(dāng)流動相遇到較大的固體顆粒時，會像流水打石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱子裝填不均勻，有些零件松動或有小凹槽，流動相的速度會很快；如果某些零件結(jié)塊或包裝緊密，則流動會很慢。腰帶變寬了。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，柱子的填料要緊密均勻，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效高。
?? (2) 分子擴(kuò)散
??分子擴(kuò)散是物質(zhì)分子從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)的運(yùn)動，也稱為縱向分子擴(kuò)散。為了減少分子擴(kuò)散，使用小而均勻的固體顆粒填充色譜柱。同時，在操作過程中，如果流速過慢，被分離的物料停留時間長，擴(kuò)散會很嚴(yán)重。
?? (3) 傳質(zhì)
??被分離的物質(zhì)必須在流動相和固定相中平衡，這樣才能形成一個狹窄的區(qū)域。在液相色譜中，溶質(zhì)分子在兩個液相之間分離。制備或吸附和解吸在固相上需要一定的時間。流速快時，傳遞速度慢，在達(dá)到平衡動態(tài)相前向前移動。這些物質(zhì)的非平衡運(yùn)動使區(qū)域變寬。
?? (4) 移動相流量
??當(dāng)流速過低時，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，尤其是在氣相色譜中。例如，如果將理論塔板高度與流速作圖，則理論塔板高度隨著流速的增加而迅速降低。當(dāng)達(dá)到最小值時，隨著流速的增加，傳質(zhì)將起主要作用，理論塔板高度再次增加。在高效液相色譜中，較快的流速影響不大，但在凝膠過濾色譜中，由于物質(zhì)必須滲透到凝膠內(nèi)部，傳質(zhì)影響很大，流速會降低柱效.
?? (5) 固定相顆粒大小
??固定相顆粒越小，柱效越高，流動相流動阻力越大。必須增加壓力才能使其流動。